1标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50L;。
2加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液4
0,然后再加待测样品10μ（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.加酶：每孔加入酶标试剂100μ，空白孔除外。
4.温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
5.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。
6洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复次拍干。
7.显色：每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀，37C避光显色15分钟.
8.终止：每孔加终止液50μ，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
9.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。